SANDWICH ELISA là gì?

ELISA sandwich là một loại ít phổ biến của kỹ thuật ELISA, nhưng rất hiệu quả trong việc phát hiện kháng nguyên trong mẫu. Hơn nữa, nhiều bộ kit thương mại ELISA được xây dựng dựa trên loại ELISA này.

ELISA sandwich định lượng kháng nguyên giữa hai lớp kháng thể (kháng thể bắt- capture và phát hiện- detection). Các kháng nguyên được định lượng phải chứa ít nhất hai epitope kháng nguyên có khả năng liên kết với các kháng thể, ít nhất là với hai kháng thể hoạt động trong kỹ thuật sandwich. Các kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng đều có thể được sử dụng như là các kháng thể bắt và kháng thể phát hiện trong hệ thống ELISA sandwich. Kháng thể đơn dòng có một epitope duy nhất cho phép phát hiện và định lượng tốt sự khác biệt nhỏ trong kháng nguyên. Một kháng thể đa dòng thường được sử dụng như các kháng thể bắt giữ càng nhiều kháng nguyên càng tốt. (Epitope- Quyết định kháng nguyên, là vị trí trên kháng nguyên, nơi gắn với kháng thể).

Quy trình ELISA sandwich có thể khó khăn để tối ưu hóa và cần phải kiểm tra các kháng thể bắt cặp sai. Điều này đảm bảo các kháng thể này phát hiện được các epitope khác nhau trên một protein đích để chúng không cản trở các kháng thể đang gắn.

Các bước thực hiện:

Chuẩn bị bề mặt đã biết trước lượng kháng thể bắt được gắn.Khóa các vị trí bám không đặc hiệu trên bề mặt.Cho các mẫu có chứa kháng nguyên lên đĩa.Rửa đĩa, để loại bỏ các kháng nguyên không gắn.Thêm một kháng thể đặc hiệu vào, và gắn với kháng nguyên (do đó gọi là "sandwich": kháng nguyên bị kẹp giữa hai kháng thể);Thêm kháng thể thứ cấp liên kết enzyme - đây là kháng thể phát hiện, kháng thể này sẽ liên kết đặc hiệu với vùng Fc của kháng thể (không đặc hiệu).Rửa đĩa, để các liên kết enzyme- kháng thể không gắn bị loại bỏ.Thêm cơ chất của enzyme để tạo màu hoặc tín hiệu huỳnh quang hoặc điện hóa.Đo độ hấp thụ hoặc huỳnh quang hoặc tín hiệu điện của các giếng để xác định sự có mặt và số lượng kháng nguyên.

Những hình ảnh ở phía dưới bao gồm việc sử dụng một kháng thể thứ cấp liên kết với enzyme, mặc dù, theo phương diện kỹ thuật, điều này là không cần thiết nếu các kháng thể sơ cấp liên kết với enzyme. Tuy nhiên, việc sử dụng một liên kết kháng thể thứ cấp sẽ tránh được quá trình tốn kém của việc tạo ra các kháng thể liên kết enzyme cho mỗi kháng nguyên mà người ta muốn phát hiện. Bằng cách sử dụng một kháng thể liên kết enzyme liên kết với các khu vực Fc của kháng thể khác, một kháng thể liên kết enzyme giống như vậy có thể được sử dụng cho một loạt các thí nghiệm. Nếu không có kháng thể bắt giữ ở lớp đầu tiên, bất kỳ protein trong mẫu (bao gồm các protein huyết thanh) cũng có thể hấp phụ lên bề mặt đĩa, làm giảm số lượng kháng nguyên cố định được. Sử dụng các kháng thể đặc hiệu đã được tinh sạch để gắn với các kháng nguyên trong đĩa sẽ giúp giảm bớt việc làm sạch kháng nguyên từ một hỗn hợp phức tạp trước khi định lượng, đơn giản hóa phân tích và tăng độ đặc hiệu và độ nhạy của thí nghiệm ELISA sandwich.

(1) Đĩa được phủ một lớp kháng thể bắt giữ;

(2) Thêm mẫu, bất kì kháng nguyên nào có mặt sẽ liên kết với kháng thể bắt giữ;

(3) Kháng thể phát hiện được thêm vào, và gắn với kháng nguyên;

(4) Kháng thể thứ cấp liên kết enzyme được thêm vào, và gắn với kháng thể phát hiện;

(5) Thêm cơ chất của enzyme và phát tín hiệu.

Ưu điểm của phương pháp Sandwich ELISA:

+ Mẫu không cần phải được tinh sạch trước khi phân tích.

+ Độ đặc hiệu cao, vì sử dụng hai kháng thể nên các kháng nguyên/ chất phân tích được bắt và phát hiện đặc hiệu.

+ Thích hợp cho các mẫu phức tạp, bới vì các kháng nguyên không yêu cầu đòi hỏi phải tinh sạch trước khi tiến hành định lượng.

+ Linh hoạt và độ nhạy cao, vì cả hai phương pháp phát hiện trực tiếp và gián tiếp đều có thể được sử dụng. Độ nhạy cao hơn 2-5 lần so với phương pháp ELISA trực tiếp hoặc gián tiếp, nhưng thấp hơn ELISpot.

Lê Văn Công

Tài liệu tham khảo: Sandwich ELISA